ELISA实验各类样本的收集要点

各位科研/临床检测的小伙伴们，是不是有时会对着ELISA曲线上诡异的标准曲线或飘忽不定的样本OD值抓狂？排除掉试剂盒、操作和仪器问题后，样本本身往往才是“罪魁祸首”！

样本收集与处理，是ELISA成功的第一步，也是最容易被忽视的一步。今天，我们就来系统梳理一下各类样本的收集要点，从此告别因样本问题导致的数据不可靠！

第一部分：核心原则——万变不离其宗

在进行任何具体操作前，请牢记这三个黄金法则：

1. 保持一致性： 同一次实验的所有样本，采集时间、患者状态（如空腹）、容器、处理流程和保存条件必须严格一致！

2. 避免污染： 使用无菌、无热原的一次性耗材。避免交叉污染和微生物污染。

3. 及时处理： 大部分样本在室温下不稳定，采集后应尽快按标准程序处理分装，并放入合适温度保存。

第二部分：分门别类——常见样本收集指南

液体样本

液体样本处理原则：所有的液体样本，用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分）

   1、血清

血清是ELISA实验最常用的样本，其预处理也十分简单。使用无热原无内毒素的试管或离心管采集血液样本，将试管或离心管在室内温度下放置自然凝固（视室温环境10分钟到2小时不等）或4℃过夜，分离出血清，（建议倾斜试管或离心管以扩大液面的横截面，使血清能更大程度的分离出来，），2-8℃条件离心5分钟左右（5000-6000转/分钟），仔细收集上清，立即进行测定，建议在-20℃或-80℃下将收集的血清分装保存，避免反复冻融，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

注意事项：在收集血液样本的过程中应避免溶血，因为红细胞在溶解时会释放具有过氧化物酶活性的物质，这种情况下，ELISA实验中将会出现非特异性显色反应，导致检测结果不准确，出现假阳性结果。另外，样本还应避免细菌污染，因为细菌可能含有内源性HRP，也会导致检测结果不准确。

   2、血浆

应根据标本的要求选择EDTA、肝素钠、枸橼酸纳或柠檬酸钠作为抗凝剂，使用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液样本，采集后30分钟内，混合10-20分钟后，2-8℃条件离心5分钟左右（5000-6000转/分钟），仔细收集上清液（血浆），建议在-20℃或-80℃下将收集的血清分装保存，避免反复冻融。样本应避免溶血或高血脂。保存过程中如有沉淀形成，使用前应该再次离心。

注意事项：检测前请仔细阅读ELISA试剂盒说明书，查看该试剂盒针对抗凝剂是否有特殊要求。

   3、尿液

用无菌管收集，2-8℃条件离心5分钟左右（5000-6000转/分钟）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

   4、细胞培养上清

检测分泌性的成份时，用无菌管收集。将细胞培养上清液吸入离心管中并以2-8℃条件离心5分钟左右（5000-6000转/分钟），除去细胞碎片和杂质，收集上清液备用，样本保存在-20℃或-80℃，避免反复冻融，保存过程中如有沉淀形成，使用前应再次离心。

   5、脑脊液

用无菌管收集，2-8℃条件离心5分钟左右（5000-6000转/分钟），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，使用前应再次离心。（采集大鼠脑脊液）的方法：采集脑脊液时，用湿纱布擦试大鼠颈背部皮肤，剪去背毛暴露皮肤。两耳连线剪一横切口(1. 5cm左右)，在其中点向尾侧沿皮下剪开2cm，将皮分离两侧，扩大视野。紧贴大鼠头骨依次逐层剪切各肌层，并断端依次拉向尾侧扩大视野。注意，有出血时用干纱布按压止血，保持术口清晰。接近颈后黄韧带时，小心地用7号注射针头分离覆盖的肌肉，暴露寰枕膜。用1ml注射器(针头用止血钳使针尖与针体成150度钝角)，针斜面向上，针尖端近水平刺入蛛网膜下腔，固定针体，缓慢抽取脑脊液，一般采集量为100-200微升。)

   6、唾液

用无菌管收集，2-8℃条件离心5分钟左右（5000-6000转/分钟），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，使用前应再次离心。

固体样本

处理原则：称取1g的固体样本，用9ml的合适缓冲液溶解，分泌蛋白可以直接离心取上清检测，细胞内的蛋白，要先收集细胞，再用合适方法破碎，离心取上清测试。

   1、组织标本

切割标本后，称取1g组织，加入9ml的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。2-8℃条件离心5分钟左右（5000-6000转/分钟），仔细收集上清。分装一份待检测，其余冷冻备用，保存过程中如有沉淀形成，使用前应再次离心。对于植物组织，不好匀浆的话，就在液氮中充分研磨。

   2、细胞内蛋白样本

许多待测蛋白不是分泌蛋白，而是存在于细胞内的蛋白，这个时候，要先收集细胞，洗涤干净，再破碎细胞，离心取上清。

    2-1、培养的细胞

A、动物细胞：用PH7.2-7.4的PBS稀释细胞悬液，使细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融（如果反复冻融，破碎效果不好，就采用超声波破碎），以使细胞破坏并放出细胞内成份。2-8℃条件离心5分钟左右（5000-6000转/分钟），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，使用前应再次离心。

B、植物细胞：用PH7.2-7.4的PBS稀释细胞悬液，使细胞浓度达到100万/ml左右，置于冰盒上，用超声破碎仪，设置破碎2s，冷却30s的方式，充分破碎细胞，以使细胞破坏并放出细胞内成份。2-8℃条件离心5分钟左右（5000-6000转/分钟），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，使用前应再次离心。

    2-2、组织的细胞

切割标本后，称取1g组织，加入9ml的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。2-8℃条件离心5分钟左右（5000-6000转/分钟），去除上清，再用pH7.2-7.4左右的PBS小心洗涤沉淀的细胞三遍。再用上述的细胞破碎方法破碎细胞。

   3、土壤

称取1g土壤，加入9ml的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工将标本充分混匀。2-8℃条件离心5分钟左右（5000-6000转/分钟），仔细收集上清。分装一份待检测，其余冷冻备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。如果是测分泌蛋白，直接取上清检测，测试细胞内蛋白，要破碎细胞。 

我们罗列的是通用的样本处理方法，无法涵盖各种样本，对于一些特殊样本，建议实验人员多参考已发表的文献，自行设计合理的样本处理方法

第三部分：避坑指南——常见问题QA

Q： 血清离心后发现仍有溶血，能用吗？
A： 谨慎！ 严重溶血（样本变红）会释放血红蛋白干扰检测，可能导致假阳性/假阴性。轻度溶血需评估影响，严重溶血建议重新采样。

Q： 样本可以反复冻融几次？
A： 强烈建议不超过3次！ 反复冻融会导致蛋白降解、聚集，严重影响结果。分装是关键！

Q： 从冰箱取出的冻存样本如何解冻？
A： 应置于 4°C冰箱缓慢解冻，或室温下在流动冷水中快速解冻。切勿在37°C水浴中长时间解冻，高温会加速蛋白降解。解冻后充分混匀再检测。

Q： 样本浓度超出标准曲线范围怎么办？
A： 稀释！ 使用试剂盒推荐的样本稀释液（或零标准品/缓冲液）进行稀释复测。记录稀释倍数，计算结果时需乘以该倍数。

结语

细节决定成败。规范的样本管理，不仅是实验成功的基础，更是科研诚信和结果可重复性的保障。花在样本准备上的每一分细心，都会在最终的数据质量上得到回报。快把这篇文章收藏或分享给实验室的小伙伴吧，让我们一起夯实ELISA实验的基石！

声明： 本文为通用技术指导，具体实验请务必参照所用ELISA试剂盒说明书及所在领域的特定操作规范。