原来如此！！ELISA基础及要诀 第2回

我们将为大家介绍市售的ELISA试剂盒的一般操作方法和要点。我们推荐的方法可能会和试剂盒制造商推荐的方法不同。实际使用时请按照试剂盒的说明书进行操作。

要点①：测定前的检查

【收货时的检查要点】

确认收货时产品状态。对收货时产品的运输温度，包装完好性等状况进行确认。

 

【冷藏品保存要点】

■ 如果试剂不能冻结，放入冰箱前检查设定的温度是否合适。

■ 为避免试剂冻结，不要把试剂放在冰箱出风口直接对着冷气的位置。

■ 冰箱的温度过低可能会导致试剂盒里浓缩清洗液中的盐离子析出。

■ 正确摆放试剂，避免试剂倒置或侧向放置。

*孔板中填充了稳定保存液，倒置存放的话会使抗体固相面接触到气泡。

 

【实验室及仪器的检查要点】

■ 选择能保证反应温度的实验室。

①不要靠近空调，恒温器，高压灭菌器，电脑等热源。

②选择气流较小的地方（推荐风速低于0.4m/sec）。

③推荐湿度30%以上。

④避免阳光直射。

■ 定期校正移液枪。

■ 定期保养自动洗板机和酶标仪等仪器。

 

要点②：正确使用移液枪

■ 关于移液枪的操作

在ELISA检测中，标准溶液的配制，试剂溶液的稀释配制以及将标准溶液、检测样本或试剂溶液分注到96孔板中都需要用到移液枪。为了使这些操作都有良好的重复性，最好使用操作熟练的移液器，并按照移液枪的操作规程进行操作。

 

■ 关于移液枪的选择

向96孔板中分注5μL,10μL,50μL,100μL等体积的溶液时。选择量程合适的移液枪，例如，分注5μL时选择最大量程为10μL的移液枪，分注50μL时选择最大量程为100μL的移液枪。

96孔板全部分注时最好使用连续分液器。使用校准保养过的电动移液器。

 

要点③：如何向孔板中加液

【加液前的准备】

■ 对96孔板做好标记，确认好加入孔板中的溶液种类。

■ 96孔板恢复至室温后撕去上面的封板膜。

■ 带金属盖的孔板在拿掉盖子时要用油性笔在盖子的边缘标记编号。

■ 如果试剂盒里全部试剂都需要恢复至室温，请在恢复至室温后再使用（复温要1个半至2个小时），特别是缓冲液和清洗液。

 

【标准液的分注】

■ 从0浓度（Blank）或者浓度最低的标准液开始分注。连续分注时最好也从浓度低的孔开始。

■ 20分钟左右完成一块孔板的溶液分注。进行高精度的分液操作时，特别要注意孔板的干燥。

■ 如果不是连续分液，那么每分注一个孔最好更换一个枪头，避免交叉污染。

■ 检测样本需要稀释时，要事先稀释好。

■ 注意不要忘记加入标准液，检测样本和二抗。

■ 加液时避免产生泡沫。
                                  
 

要点④：枪头使用的方法

枪头的使用方法主要有两种。最好统一使用一种方法。

 

● 预先浸湿法

①装好新的枪头后，在第一停点（移液枪最初停止的位置）的范围内吸取、排出溶液1~2次，即进行“预先浸湿”，再吸满溶液。

②用枪头的顶端轻轻触碰容器的内壁，去除顶端外侧附着的溶液后提起移液枪（touch and go）（图1）。

③让枪头的顶端接近板孔内壁，排出溶液。这时，将按钮按到底，排出全部溶液（blow out）。

④在孔的内壁进行touch and go后提起移液管，更换枪头。这时注意枪头的顶端不能接触到内壁。

 

●共洗法

这种方法适用于已经将缓冲液等加入孔板或试管里的情况。最好在分注微量检测样本或微量标准液时使用这种方法。

①装好新的枪头后，按压按钮到第一停点的位置，轻轻地吸取溶液。

②在容器的内壁进行“touch and go”后提起移液枪。

③将枪头的顶端放进已经加入缓冲液的孔中排出溶液，在第一停点的范围内上下按压按钮“共洗”1-2次，最后排出全部溶液。

④在孔的内壁进行touch and go后提起移液枪，更换枪头。分注时枪头的顶端不要接触96孔板的内壁。

 

移液时的要点（一例）

要灵活运用预先浸湿法和共洗法来进行正确的注液。避免移液枪排出溶液时产生气泡。移液时枪头不要接触孔的底面和内壁，避免剥离固定的抗体。要用稳定的速度来按压移液枪。最后再进行“touch and go”。

 

本报道根据若林克己著的《ELISA A to Z》(Shibayagi株式会社发行)，由Shibayagi株式会社进行编辑。