要点⑤：试剂的稀释

试剂稀释的准备工作

1. 检查需要稀释的试剂。

2. 试剂盒中需要恢复至室温的试剂要提前恢复至室温。特别是冬季和早春季节，试验台的表面温度即使在暖气房也不会马上上升。可在试验台上铺上吸水纸后再放上试剂盒内试剂，待恢复至室温。

3. 试剂原液分装前需充分搅拌均匀，注意避免产生气泡。

4. 标记试剂等液量较少的试剂搅拌后短暂离心，待盖子、瓶壁上粘附物质滑落后取用。

5. 用缓冲液稀释试剂原液1000倍以上时，推荐使用分步稀释。

例：10倍稀释

试剂原液20μL+ 缓冲液180μL

试剂原液10μL+ 缓冲液90μL

例：1000倍稀释

10倍稀释溶液100μL+ 缓冲液9,900μL

可以从10,000μL缓冲液中吸走100μL，之后加入100μL试剂原液。

稀释后充分搅拌，注意避免产生气泡。

6. 试剂根据需要现用现配。

 

要点⑥：边缘效应

位于孔板外围的孔位与内部孔位相比，容易受到外部温度的影响，造成反应过度或者反应过慢等现象。

一般来说，在冰箱中保存的孔板、试剂、样本，如果在低于室温的状态下使用，外围升温快，反应加速，吸光度变高。显色液在较低温度使用时显色效果更明显。冬天容易受加热器或空调暖风的影响；夏天容易受空调冷风的影响。所以，可能会造成孔板中空白对照孔（浓度0）的吸光度高于最低浓度的标准溶液（加热时）；或设置复孔的标准品在测定时，边缘的空白对照孔的吸光度也会受到影响。

边缘现象解决办法

1. 测量前1.5h~2h，把孔板、试剂和样品从冰箱中取出，恢复到合适的反应温度。

2. 测量开始前检查试剂的温度。

3. 不要在受空调、恒温浴、PC、人等热源影响的地方进行测量。

4. 保持恒定的反应温度。

5. 特别需要注意清洗液的使用温度。清洗液用量较多，调整温度时需要花费时间。如果清洗液的温度与反应温度不同，每次洗涤时，孔板的温度都会改变。

6. 使用封板膜或板盖。

7. 尽量保持孔板温度传递稳定。

8. 使用恒温箱时，缓冲液和清洗液也需放入恒温箱内。

*实验前请确认试剂的稳定性。

 

要点⑦：洗板

洗板是ELISA操作中非常重要的步骤之一。如果清洗不彻底会由于非特异性反应造成孔板吸光度上升，无法保证低浓度测定范围内的灵敏度。为防止出现以上状况必须严格按规范进行清洗操作。

【清洗要点（手动洗板）】

1. 如果包含浓缩清洗液，需待纯净水的温度恢复至室温后稀释。液体的温度变化比室温慢，操作开始时清洗液的温度可能与反应温度不同。若使用预先准备好的纯净水需特别注意，建议操作前要测量温度。

2. 使用恒温箱，将洗涤液也放入箱内，尽量保持与反应温度一致。

3. 加入样品、标准品，在指定时间完成反应后的第一次洗板：倒掉反应液，让孔板每个孔都充入清洗液，注意避免清洗液溢出、飞溅或窜孔。每孔的清洗液大概在250 〜300μL。从第二次洗板开始，清洗液溢出也没关系。

4. 洗板时，需要一定强度的水流才能充分洗涤孔板，否则会引起清洗不足。特别是使用8道、12道移液器操作的时候，避免清洗不足情况发生。

5. 过氧化物酶结合物反应后的清洗步骤很重要。使用移液器向孔板中加入清洗液时容易造成清洗不足，需增加清洗次数。（例如，指定清洗4次需要加到6~8次）。

6. 清洗液填满孔板后在手掌上朝水平方向以画圆方式轻微晃动5~10秒后立刻翻转孔板把清洗液倒出，这样可以加强清洗效果。

7. 洗净后，不要让孔板内的液体干燥，否则会造成空白对照测定值增加。洗板操作开始前必须准备好后续操作需要使用的试剂。

 

ELISA疑难解答

A：显色时颜色浅或不显色的原因和对策

1. 未加入标准品或样品

2. 未加入与显色相关的试剂

①生物素标记抗体

②过氧化物酶结合抗体

③抗生物素蛋白HRP

④TMB

3. 错用显色相关溶液或者稀释不均的生物素抗体、抗生物素蛋白HRP等

4. 酶抑制剂的污染

稀释用容器粘附叠氮钠（NaN3）会造成抗生物素蛋白HRP失活。

*叠氮钠作为防腐剂经常被加在各种溶液中（特别是缓冲液）。特别注意装过这些溶液的容器。使用含有抗凝血剂NaF的采血管或含叠氮钠的样品时，在抗原抗体反应后、应尽量清洗干净或避免使用该类样本。

5. 孔板的清洗

自动清洗机的清洁力度调节过大会剥离固相的抗体或反应物。需设定适当的清洗强度。建议清洁时设定为平板清洗模式。

人工清洗时，使用移液器或洗瓶管嘴不要接触孔表面。
                                    
                                           用喷射瓶清洗十分便利。
 

6. TMB溶液从冰箱取出后可马上加入吗？

没有充分恢复至室温会造成显色弱（室温反应下）。

 

B：肉眼可见显色但无法测量吸光度的原因和对策

可能是读板器测量波长的偏差，需调整读板器的波长。使用滤光式读板器检查波长是否正确。

 

C：标准曲线不好的原因和对策

○标准曲线没有向右上移

全部吸光度低

样品是显色的

→ ●未加入标准品  ●未加入标准品原液  ●加错标准品原液

○样品不显色

→ ●显色剂稀释错误  ●加错显色剂  ●加错第2抗体  ●漏加第2抗体  ●第2抗体变质、稀释错误 

○全部吸光度低

→ ●显色剂变质（氧化）

○标准曲线向右下移

→ ●标准曲线的添加顺序弄反

○标准曲线凹凸不平

→ ●稀释标准品过程出现错误

○标准曲线在右侧，无法检测灵敏度

→ ●标准品失去活性  ●反应时间错误

○包括空白对照（浓度0），设置复孔的标准品在测定时，周围板孔的吸光度总是高于内侧板孔测定的吸光度。

→ ●可能是边缘现象引起的。

○一般注意事项

使用标准品原液前请先用漩涡振荡器充分混匀，注意不要起泡。

稀释标准品溶液时，吸取高浓度的标准品溶液加入后续装有缓冲液的试管后，充分混匀后再进行下一步操作。

 

本文是在若林克己著《ELISA A to Z》（Shibayagi株式会社发行）基础上，Shibayagi株式会社进行编辑的。