到底什么是分子生物学呢？

分子生物学（molecular biology) 是从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学。自 20 世纪 50 年代以来，分子生物学是生物学的前沿与生长点，其主要研究领域包括蛋白质体系、蛋白质-核酸体系（中心是分子遗传学) 和蛋白质-脂质体系（即生物膜）。

1953 年沃森、克里克提出 DNA 分子的双螺旋结构模型是分子生物学诞生的标志。

中心法则被称为分子生物学的中心教条，是指遗传信息从 DNA 传递给 RNA，再从 RNA 传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程（如下图所示）。今天，我们就以中心法则的传递顺序来聊一聊相关的分子生物学实验。
 

中心法则示意图
 

一、DNA 相关实验

1．DNA 的提取

原理：DNA 与蛋白质构成染色体，而染色体存在于细胞核中，外有核膜和胞膜等。提取 DNA 须先将组织消化或剪切分散成单个细胞，然后用蛋白酶 K、SDS 或 CTAB 等试剂破碎核膜、胞膜等，使蛋白质变性并降解成小肽或氨基酸。此时 DNA 从核蛋白中游离，同时 RNA 酶降解污染的 RNA，再利用饱和酚抽提使蛋白质与 DNA 脱离，在高盐存在下用乙醇沉淀收集 DNA，最后得到欲提取的 DNA。

2．PCR-- 用于放大扩增特定的 DNA 片段

原理：PCR（聚合酶链式反应），在载体构建过程中主要用于 DNA 的快速扩增以获得大量基因片段。在模板 DNA、引物和 4 种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于 DNA 聚合酶的酶促合反应，将待扩增的 DNA 片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经变性--退火--延伸三个基本反应步骤，三步反应的多次循环，使 DNA 片段呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量特定基因片段。
 

PCR 原理图
 

3. 凝胶电泳-- 分离鉴定 DNA

原理：DNA 分子在其等电点的 pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，电泳后不同大小的 DNA 分子会因其分子质量的差别而呈现迁移位置的差异。再将其与已知分子质量的标准 DNA 同时电泳的结果相比较，就可以鉴定待测 DNA 的大小，从而进一步进行分离纯化。
 

凝胶电泳结果图

胶回收

原理：在 PCR 产物序列测定，或者重组 DNA 等实验中，常常需要从凝胶中回收和纯化 DNA。通过琼脂糖凝胶电泳，使目的 DNA 片段转移到凝胶内，经 65℃ 水浴 5～10 min，使之熔化成液态，用饱和酚抽提，就可以分离到所需的 DNA 片段。目前较常用的是低熔点琼脂糖挖块法。

5. 酶切与连接

酶切：主要依赖于 DNA 限制性内切酶的作用，其基本原理是利用限制性内切酶对 DNA 上特定序列的识别，来确定切割位点并实现切割，从而获得所需的特定序列。以常用的 EcoRⅠ为例说明，EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

 

示意图：

               5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'

               3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'

 

连接：主要依赖于 DNA 连接酶的作用，将由限制性核酸内切酶「剪」出的粘性末端重新组合，也就是连接 DNA 链3‘－OH 末端和另一 DNA 链的 5’－P 末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的核酸片段连成完整的链。

至此，从最初的 DNA 提取，经过以上一系列的反应之后，我们的质粒载体构建可以算是初步完成，再经过转化、筛选、鉴定即可得到用于后续实验的阳性质粒。

二、RNA 相关实验

1. RNA 提取

原理：Trizol 中含有的高浓度强变性剂异硫氰酸胍和酚等成分，可破坏细胞结构，使细胞质中的 RNA 释放出来并解离，同时异硫氰酸胍和 β-巯基乙醇使 RNA 酶失活，避免 RNA 的降解，再通过有机溶剂抽提、离心，去除核 DNA、蛋白质和细胞残片等成分，从而得到纯化的总 RNA。

2. 反转录 PCR（RT-PCR）

原理：反转录 PCR（reversetranscription-PCR, RT-PCR），是 PCR 的一种广泛应用的变形，一条 RNA 链被逆转录成为互补 DNA，再以此为模板通过 PCR 进行 DNA 扩增。

3. 荧光定量 PCR（Q-PCR）

原理：是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。目前常用的有 SYBR GreenⅠ荧光染料法和 TaqMan 探针法。
 

荧光定量 PCR 结果图
 

三、蛋白质相关实验

核酸和蛋白质都是生物体中重要的有机物，核酸是遗传信息的载体，而蛋白质又是生命活动的体现者。那么关于蛋白质主要有哪些实验呢？

 

1.  蛋白质表达与提取、纯化

（1）蛋白表达--分析基因调控及蛋白质结构和功能

原理：蛋白表达是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。

（2）蛋白提取    

原理：同 DNA 或 RNA 的提取相似，提取蛋白的第一步是裂解细胞，第二步才是蛋白提取。目前，裂解细胞最常用的是裂解液处理法。除去裂解细胞的作用外，细胞裂解液还有以下作用：①溶解蛋白，②使蛋白变性让其稳定，③抑制蛋白酶活性。

（3）蛋白纯化

原理：蛋白纯化主要是利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。目前较常用的有凝胶过滤层析、离子交换层析、亲水层析以及疏水相互作用层析等纯化方法。

2. 蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB）

原理：WB 是在蛋白水平上检测或研究基因表达功能的一种方法。从细胞提取蛋白质并通过凝胶电泳将不同大小的蛋白质分开，分类的蛋白质被转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后与特定蛋白标记的抗体（同位素或化学发光物标记）结合，经放射自显影现出带纹，根据带纹的密度可确定蛋白质表达的相对量。
 

蛋白印迹实验结果图 
 

上面已经论述了蛋白质从提取到定量的一些基础实验，那么，我们如何对得到的蛋白质进行研究呢？接下来，我们就来看看一些常见的研究方法。

3. 蛋白质之间的相互作用

（1）酵母双杂交：将待研究的两种蛋白质分别克隆（融合）到酵母表达质粒的转录

激活因子（如 GAL4 等）的 DNA 结合结构域（DNA-BD）和转录激活域（AD）上，构建成融合表达载体，再从表达产物分析两种蛋白质的相互作用。

（2）GST-pulldown：即 GST 融合蛋白沉降技术，用于体外检测蛋白质间的相互作用。该方法利用重组技术将探针蛋白与 GST 融合，融合蛋白通过 GST 与固相化在载体上的 GTH 亲和结合，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。

（3）免疫共沉淀：以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。用于确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用。

4. 蛋白与 DNA 相互作用

染色质免疫沉淀（CHIP）：在生理状态下把细胞内的 DNA 与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，再利用抗原抗体的特异性识别反应，即可将与目的蛋白相结合的 DNA 片段沉淀下来。