近年来随着仪器和试剂的不断发展，几乎所有的免疫检测应用都可以获得荧光读数。不过，尽管免疫荧光技术能够提供灵敏而准确的结果，并适合多重检测，但优化还是必不可少的。

操作方案要优化

免疫荧光染色的操作方案通常包括：固定和透化、封闭、一抗孵育、洗涤、二抗孵育、再次洗涤以及测定读数。Clark 解释说：「大多数研究人员的染色方案都是一成不变的，因此我们建议在使用珍贵的样本材料时，花点时间优化操作方案的每一步。」

Mohan 指出：「就一抗孵育而言，你必须考虑抗体的建议稀释度，以实现高的信背比。若抗体浓度过低，则荧光信号较弱，可能难以与背景区分开，但抗体浓度过高，则会导致较高的背景染色。」

Clark 还提醒，千万不要低估各步骤之间彻底洗涤的重要性。「利用生理溶液来洗涤，可去除未结合的荧光试剂，或那些只是粘在目标上而非特异性结合的荧光试剂，从而提高信背比。」

荧光试剂要放好

尽管许多荧光基团具有相对的光稳定性，但在保存和染色过程中若未能避光，则可能导致荧光基团-抗体结合物降解，引起假阴性结果。

Clark 强调，荧光物质必须在建议温度下小心保存，并始终注意避光，以保护其光谱完整性。他特别指出，串联的荧光基团对频繁操作引起的不稳定性特别敏感。

Mohan 也补充说：「尽管免疫荧光技术提供了准确的结果，但也存在一些缺点，包括自发荧光、荧光信号的淬灭，以及标本存储过程中的信号褪色。按照建议的实验方案来操作，研究人员可以避免一些技术上的缺陷。」

选择荧光要谨慎

免疫荧光技术的一个主要优势在于它为多重检测提供了机会，如今流式细胞仪能检测每个细胞中 20 多个离散参数。在设计多重实验时，应考虑每种荧光基团的独特性质，如最大吸收波长和最大发射波长，消光系数和斯托克斯位移等因素。Mohan 表示：「人们通常要检测组织或细胞样本中的多个抗原，必须选择光谱不重叠的荧光基团。即使是好的检测系统，也无法克服仪器和试剂之间的不匹配。」

合适对照不可少

任何实验数据的分析都依赖于相关的对照，免疫荧光染色也不例外。「不加一抗，则能说明观察到的信号是否来源于二抗与组织或细胞样本的非特异性结合，」Clark 解释说。「此外，我们建议使用不表达目标的细胞或组织作为阴性对照。同时，为了确保所有组分都正常发挥作用，那些已知表达目标的阳性对照也少不了。在荧光 Western blot 或 ELISA 技术中，含有目标抗原的蛋白或肽段适合作为阳性对照。」

总之，免疫荧光染色是一种流行且强大的检测方法。通过精心选择荧光基团，并开发可靠的染色方案，你可以生成丰富的数据。