免疫印迹（Immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western Blot，WB），是一种综合性的免疫学检测技术。它利用
SDS-PAGE技术将生物样品中的蛋白质分子按分子量的大小在凝胶上分离开，然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜
上，以固相膜上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的第二抗体起反应，经过底物显色或荧光成
像等方法以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白质。WB技术现已广泛应用于蛋白水平的表达研究、抗体活性检测
和疾病早期诊断等多个研究领域。

一、蛋白样品的制备与定量
蛋白样品制备是 Western Blotting 的第一步，也是决定 WB 成败的关键步骤之一。蛋白提取总体原则与注意事项
包括：1) 尽可能提取完全或降低样本复杂度使得集中于提取目的蛋白；2) 保证蛋白处于可以溶解状态（选择合适
的裂解液的pH 、盐浓度、 表面活性剂、还原剂等）；3) 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等（冰盒中
低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）；4) 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。蛋白定量的方法有
很多种，应用较多的主要有两种：BCA蛋白定量检测法和Bradford蛋白定量检测法，用RIPA裂解液裂解得到的蛋
白样品，可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，由于含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法测定由
RIPA裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。

二、SDS-PAGE电泳

样品制备完成后，需要通过电泳将不同分子量大小蛋白有效分开，以便能够检测目的蛋白的表达水平，广泛采用的
是SDS-PAGE，在电泳体系中加入变性剂SDS和还原剂DTT或者巯基乙醇等，蛋白质分子的多聚体或者高级结构会
被打开，蛋白质氨基酸侧链和SDS结合形成蛋白-SDS复合物，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量，因此
可以有效消除不同蛋白质分子间的电荷差异和空间结构差异。所以SDS-PAGE检测时，可以利用分子筛效应将蛋白
质依据分子量大小分离开来。
 

三、转膜

转膜是将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体上，同时维持其相对位置和分辨率的过程,主要分两种：湿
转和半干转。半干转耗时短，但是更适合小分子蛋白的转印，而湿转蛋白分子量范围较宽，两者的比较见表在
Western Blot 实验中，常用的是湿转。
 

四、免疫反应与检测

转膜后凝胶中的蛋白被固定在膜上，需要有效检测目标蛋白，定性及定量样品中蛋白质与对应丰度。蛋白印迹检测使
用针对目标蛋白具有特异性的一抗，再杂交酶或荧光分子标记的二抗，然后进行检测。正确选择、使用合适的一抗和
二抗对于最大化信号，同时降低背景至关重要。蛋白上样内参的正确使用对于蛋白印迹的信号归一化也至关重要。