什么是细胞凋亡？

细胞凋亡（apoptosis）也称为程序性细胞死亡（programmed cell death），在多个信号通路的参与下，是一个
高度受控的过程。细胞凋亡不仅可以去除机体不再需要的、多余的细胞和组织，使机体正常生长和发育，而且还能
杀死过剩的免疫细胞和受到病毒感染或出现DNA损伤的细胞，最大限度地减少这些细胞对机体的威胁。

区别于损伤导致的细胞坏死，凋亡细胞的形态学特征为核染色质凝聚、细胞皱缩，以及膜结合的凋亡小体的产生，
还会出现DNA片段化和多种胞内蛋白的分解或降解。

                                   怎么检测细胞凋亡？

检测细胞凋亡的方法有很多，有根据凋亡细胞固有的形态特征，利用光学显微镜、激光扫描共聚焦显微镜和透射电子
显微镜等来观察细胞形态；也有根据细胞凋亡过程中的时相变化检测是否发生凋亡，常见的有Caspase活性检测、
Annexin V检测、线粒体膜电位检测、TUNEL检测等。细胞发生凋亡时，不同区域内（如细胞膜、细胞浆、线粒体、
细胞核等）会发生不同的生理生化改变。因此，针对不同区域的细胞凋亡检测要采用不同的方法。

                               细胞凋亡常见的检测方法：

01  线粒体功能和膜电位丧失（JC-1）
细胞凋亡有个典型特征是线粒体活性受损，包括膜电位和线粒体氧化还原能力的改变。发生这些的主要原因是线粒体
膜通透性转换孔的打开，引起离子和小分子的进出和细胞色素c的释放。

JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位，线粒体膜电位
的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。正常生理状态下，线粒体负电性高，JC-1进入线粒体以多聚体存在，红色
荧光强，细胞凋亡时，线粒体去极化产生，负电性降低，JC-1则以单体存在细胞质，绿色荧光增强。

这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。但是，这种方法不能区分细胞凋亡或其他原
因导致的线粒体膜电位的变化。
        
 

02  磷脂酰丝氨酸外翻（Annexin Ⅴ）
细胞膜在整个细胞凋亡过程中都会持续发生变化。细胞膜变形或起泡发生在细胞凋亡早期，随着细胞凋亡的进展，
细胞膜脂质成分和完整性也会发生变化。例如，磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞质膜的内部小叶外翻到外部小叶上，
进而暴露在细胞外部环境中。

Annexin Ⅴ是一种分子量为35-36kD的Ca依赖性磷脂结合蛋白，正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）
只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V作为一种
磷脂结合蛋白，可以特异性地识别凋亡细胞表面的PS, 而活细胞的PS位于细胞膜的内表面，无法与Annexin V特异性结合。
所以可以用FITC偶联的annexin V鉴别凋亡细胞和活细胞。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒标记后可以使用流式细胞
仪检测细胞凋亡。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透
过细胞膜而使细胞核红染。坏死细胞的PS也会从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面，Annexin V也能识别坏死细胞表
面的PS, 所以Annexin V无法区分坏死细胞和凋亡细胞。而PI染料能够与细胞内的DNA结合，区分坏死细胞和活细胞。早
期凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整， PI染料无法自由通过细胞膜进入细胞内与DNA结合，所以PI染料无法标记凋亡
细胞和活细胞，而PI染料却能够通过坏死细胞的细胞膜与细胞内的DNA结合，坏死细胞内PI染料被488nm激光激发后会发
射红荧光，被相应通道接收。所以Annexin V和PI同时使用，就可以区分活细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞。


 

Q1：左上象限（UL）为（Annexin V-/PI+），可能是已经没有细胞膜的细胞碎片，或者其他原因导致的死亡细胞；

Q2：左下象限（LL）为正常（活）细胞（Annexin V-/PI-）；

Q3：右上象限（UR）为晚期凋亡细胞（Annexin V+/PI+）；

Q4：右下象限（LR）为早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）。

03   半胱天冬酶活性检测试剂盒（Caspase）
半胱天冬酶（Caspase）活化是细胞凋亡早期的重要信号。半胱天冬酶属于半胱氨酸-天冬氨酸特异性蛋白酶家族，
是细胞凋亡相关的复杂细胞过程的关键调节因子。绝大多数情况下，所有的凋亡信号都会汇集到凋亡的最终执行者
Caspase-3 上。在正常细胞中，Caspase-3 以酶原形式存在，在凋亡早期 Caspase-3 被激活，并执行最后的凋亡
程序。因此可以通过检测 Caspase 3 剪切体的含量或 Caspase 3 的活性来反应细胞凋亡过程。此外，也可以通过
检测 Caspase-3 的底物——PARP 蛋白的含量来检测细胞凋亡。

 

                 半胱天冬酶活性检测试剂盒SuperViewTM 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells

 

04  DNA片段化和形态学检测（TUNEL）

细胞凋亡过程中细胞核形态变化的特征是DNA链断裂、DNA片段化、核膜降解和细胞核起泡、产生微核。

细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的
作用下，将脱氧尿苷三磷酸核苷酸(dUTP)和荧光素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，
称为TUNEL法。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。由此，
TUNEL是检测DNA片段化（细胞凋亡）的最常用方法。

                                                     TUNEL 法检测苦参碱刺激下 HepG2 细胞凋亡情况


TUNEL的全称是Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediated dUTP Nick-End Labeling，中文名为末端脱氧核
苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记。是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡
小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、
培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物
化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。